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电穿孔法提高恶性疟疾DNA疫苗免疫原性

深圳亲子鉴定 — Thu, 08 Mar 2012 08:50:47 +0000

电穿孔法提高恶性疟疾DNA疫苗免疫原性
深圳亲子鉴定机构利用体内电穿孔的免疫途径来研究不同的真核表达载体和免疫剂量对DNA疫苗M.RCAg-1和D10的免疫应答的影响。分别将M.RCAg-1和D10基因克隆到VR1012和pVAX1表达载体中，用质粒免疫小鼠，采用ELISA和IFA法比较这两种载体的免疫效果，并对基因疫苗免疫小鼠的剂量进行摸索。D10基因免疫大白兔，检测纯化IgG体外对疟原虫生长的影响。结果表明，接种抗原基因疫苗的小鼠都产生了较高滴度的抗重组蛋白抗体，并且都识别培养的恶性疟原虫天然蛋白。pVAX1-D10免疫效果优于VR1012-D10。低、中剂量组产生的抗体水平比高剂量组高。D10基因免疫大白兔后，总IgG的GIA水平为45%。pVAX1表达载体的免疫效果比VR1012表达载体好。M.RCAg-1和D10的DNA疫苗均可诱导识别恶性疟的抗体。通过电穿孔的免疫途径低剂量的DNA疫苗即可诱导高水平的抗体，并且使D10基因在家兔模型中诱导抗恶性疟原虫抑制性抗体。疟疾是当今世界对人类危害最为严重的传染性疾病之一。全球每年约有3.5亿人感染恶性疟疾，有100～150万人因这一疾病而死亡，其中大多数为非洲撒哈拉以南地区5岁以下的儿童。控制疟疾的方法包括控制传播媒介，提高诊断率和治疗效果，采取疫苗预防等。目前，如何增强疫苗在人体内的免疫效果是深圳亲子鉴定中心研究的一个关键问题。有效的红内期疟疾疫苗能够抑制裂殖子侵入红细胞，降低疟原虫密度，从而减少发病率和死亡率。本课题组对红内期多表位疫苗的研制进行了长期的探索，前期工作借鉴了分子育种技术的随机重组原理，利用表位改组技术构建了多表位基因库，并用库免疫血清筛选出高抗原性的阳性克隆，发现其中M.RCAg-1基因克隆不仅能在小鼠模型诱导交叉免疫保护而且能在家兔模型中诱导抗恶性疟原虫抑制性抗体;D10抗原也能在家兔模型中诱导抗恶性疟原虫抑制性抗体。由于以上基因均需通过表达重组蛋白后免疫，提高了疫苗的制备和保存成本，而此前在尝试应用核酸疫苗免疫的研究中，通过肌肉注射的免疫途径诱导产生的抗体水平较低，抗血清对疟原虫生长抑制作用也不明显，因此需要选择新的免疫途径。体内电穿孔作为一种有效的DNA疫苗递送途径，可以显著地增强DNA疫苗在动物体内的免疫效果。在电场的作用下，细胞膜上瞬间打开一个“孔”，能够提高目的基因进入细胞内的概率，从而提高表达效率。电穿孔导致的轻微组织损伤还可以诱导产生炎性细胞因子和淋巴细胞浸润，从而提高抗原递呈，增强机体的免疫应答。本试验采用电穿孔途径，在动物模型中观察M.RCAg－1和D10作为核酸疫苗的免疫原性及D10基因抗血清对疟原虫生长的体外抑制作用。

印迹基因中胞嘧啶甲基化尤其是CpG岛的甲基化密切相关

深圳亲子鉴定 — Mon, 16 Jan 2012 03:17:21 +0000

深圳dna亲子鉴定通过印迹基因与DNA甲基化的关系基因组印迹的分子机制与印迹基因中胞嘧啶甲基化尤其是CpG岛的甲基化密切相关。在目前发现的印迹基因中，几乎所有印迹基因的某一亲等位基因中都有一段甲基化序列，即DMR。剔除小鼠甲基转移酶的重要基因Dnmt1后胞嘧啶就不能发生甲基化，可导致小鼠基因组印迹缺失，由此表明甲基化对维持基因印迹有重要作用。在配子细胞形成过程中，DNA甲基化模式的建立是引起父源和母源基因活性差异的关键，高度甲基化可使印迹基因不表达或表达活性低。在配子形成过程中或原核期，源于双亲的等位基因可以被修饰成不同的印迹，这种印迹决定了基因在随后的发育过程中是否发生以及何时何地发生甲基化等作用。
5印迹基因与环境的关系除了调节胎盘生长和营养物质的转运，胎盘的印迹基因会随着环境的改变而发生表型改变。一般而言，胎盘中印迹基因的调控比胎儿或胚胎组织对环境改变有更高的敏感性］。尤其是改变早期胚胎着床前的环境对胎盘中关键印迹基因的表达起着
重要的影响。这些环境改变包括超排卵，体外受精，胚胎培养和移植。胚胎体细胞和干细胞的克隆。这与胎盘异常表达以及稀有的印迹基因疾病在人类辅助生殖技术下的妊娠中增加一致。母亲的营养因素即使在晚期发生改变，在啮齿类动物的胎盘中同样可以出现印迹基因表达的改变。无论时间顺序如何，大多数环境的改变都可导致胎盘H19-IGF2基因座表达的改变，并与甲基化的改变导致的印迹基因缺失和双等位基因表达相伴随。依据印迹调控区甲基化的变化，胎盘IGF2的表达水平有可能上升或下降。H19-IGF2甲基化的改变同样也可以在克隆、胚胎培养和营养低下的母亲后代胎体中观察到。然而，并不是所有环境因素导致的胎盘印迹基因表达的改变都与甲基化的转变有关。
6双胎妊娠中印迹基因表达的研究进展双胎生长不一致是多胎妊娠中的一种独特并发
症，包括双胎表型、基因型以及生长模式的不一致，也可以单指两者之间的出生体质量相差大于20%。印迹基因有可能是导致双胎生长不一致的重要原因之一，但是异常的印迹基因是否在胎盘发生尚不清楚。有研究表明，IGF-2启动子3以及IGF2的表达与特异性的印迹缺失与双胎表型的不一致密切相关。对单卵双生和双卵双生的双生子表型差异研究发现，表观遗传修饰是导致遗传物质一致的单卵双生子出现个体差异的主要原因。
7小结
综上所述，基因组印迹在决定胎盘的表型方面起着重要的作用。印迹基因调节了胎盘内多种细胞类型的生长，影响母亲胎儿交换界面上营养物质的被动弥散，进而影响胎盘和胎儿的生长发育。基因组印迹的分子机制与印迹基因调控区、DMR密切相关，甲基化的出现与否影响到印迹基因的表达或缺失，从而影响胎儿的生长发育。另外，印迹基因表达同样也受环境因素的影响。异常的印迹基因有可能是双胎生长不一致的一个重要的原因，但是异常印迹基因在双胎中所起的作用有待证实。

印迹基因在人类胎盘表达的研究进展二

深圳亲子鉴定 — Mon, 09 Jan 2012 04:00:36 +0000

人类胎盘中的印迹基因及其功能印迹基因与胎儿的生长发育和胎盘的功能密切相关，印迹基因的表达失调，可导致胎儿发育的异常，包括散发的、遗传的和环境诱导下的生长紊乱，导致发生遗传性疾病。人类印迹基因疾病较罕见，但却包含多种涉及生长和神经系统发育的病理特征。迄今为止发现的多种印迹基因均在胎盘有表达。印迹基因不恰当表达导致的疾病有可能部分或者全部与胎盘的功能异常有关。
印迹基因与胎儿及胎盘的发育经典的印迹基因为父源表达的IGF2和母源表达的IGF2R。动物实验显示正常情况下IGF2可促进胎儿生长，但IGF2表达下调可引起胎儿的生长受限，而双等位基因的表达以及IGF2转录的增加又会导致胎儿的过度生长。母系表达的IGF2R则起着相反的作用。表型异常通常与父源印迹基因的缺失，以及母源印迹基因的表达增加有关。塞尔沃-鲁塞尔综合征(Silver-russellsyndrome，SRS)，即不对称-短身材-性发育异常综合征，主要表现为严重的宫内胎儿生长受限，可能是由于H19特异性甲基化区(Differentiallymethylatedregion，DMR)缺陷导致的IGF2转录减少引起。转基因大鼠实验中，同窝幼仔中携带有母亲突变CDKN1C基因的幼鼠表现出与子痫前期相似的特征，即高血压、蛋白尿和异常的滋养细胞增殖。以上表明CDKN1C在子痫前期的发病中起着重要作用，而其他印迹易感基因在妊娠合并症中所起的作用仍需进一步研究明确。PHLDA2印迹基因主要在胎盘中表达，其在足月胎盘中的表达水平与胎儿的出生体质量呈负相关。由于PHLDA2是母源表达基因，这种趋势与双亲遗传竞争学说相一致，即母源表达的基因作用是限制母亲资源的供给。两项关于正常妊娠胎盘与宫内胎儿生长受限胎盘的比较研究发现，宫内胎儿生长受限胎盘PHLDA2表达水平明显高于正常妊娠胎盘，进一步证明PHLDA2在胎盘的表达水平对胎儿的生长起重要作用。父源表达的MEST基因在人类蜕膜和滋养层组织的血管形成中起重要作用，在胎盘中呈高表达。MEST位于7号染色体，约7%～10%的SRS患者合并母源7号染色体UPD。
目前，在人类身上没有直接的证据证明MEST与疾病有关，但是在动物实验中MEST基因表达缺失表现为产前、产后胎儿生长受限。母源表达的GRB10是一种生长因子结合蛋白，印迹基因主要表达于细胞滋养层，而其他部位均为双等位基因表达。GRB10也位于7号染色体。母源7号染色体UPD出现在7%～10%的SRS病例中，SRS可能由母源UPD或具有双重母源的GRB10引起。然而目前在人类尚没有直接证据表明GRB10的表达跟人类生长有关。在鼠类胚胎，GRB10在母源染色体广泛表达，如果该印迹基因缺失将导致胚胎的过度生长，这种基因缺失的新生鼠比野生型同胞鼠在出生时大30%，且这种情况与胎盘迷路过度生长相伴随。

印迹基因在人类胎盘表达的研究进展

深圳亲子鉴定 — Mon, 09 Jan 2012 03:58:32 +0000

印迹基因在人类胎盘表达的研究进展
印迹基因是一种调节双亲资源分布的内在机制，近年来有关印迹基因的研究进展迅速新的印迹基因不断地被发掘出来，印迹基因的表达具有时段性并且具有高度的组织特异性。该文介绍了印迹基因在胎盘中所起的作用，以及DNA甲基化与印迹基因的关系，并且阐述了印迹基因在双胎个体生长发育中所起的作用。
20世纪80年代，研究人员在小鼠原核基因移植实验中发现父源与母源基因组的功能具有不等同性。后续研究发现人类亦存在几种不遵循孟德尔遗传定律的综合征，如15q11-13区父源表达基因缺失或母源单亲二倍体(Uniparentaldisomy，UPD)引起的普拉德-威利综合征(Prader-Willisyndrome，PWS)，主要表现为先天性神经异常发育;同一区段母源表达基因缺失或父源UPD引起的安格曼综合征(Angelmansyndrome，AS)，主要表现为智能障碍、常发笑、移动与平衡运动困难的快乐木偶综合征。
PWS与AS表明父亲和母亲的基因组对个体发育有不同的影响。依靠单亲传递某些遗传学性状的现象称为基因组印迹，体现为只有一个亲本的等位基因表达，而另一亲本的等位基因不表达或很少表达的现象，具有相应差异的基因称为印迹基因。来源于父亲的等位基因不表达称为父源印迹，来源于母亲的等位基因不表达称为母源印迹。印迹基因的主要特点包括:①单等位基因表达;②富含胞嘧啶鸟嘌呤(Cytidine-phosphate-guanosine，CpG)岛，容易被甲基化;③呈簇排列，很少单独存在;表达或抑制印迹调控区(Impritingcontrolregions，ICR);④在体细胞分裂中稳定遗传。DNA甲基化作为DNA序列的修饰方式，是一种重要的表观遗传机制，其能在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能，是基因组印迹调控的关键。多数印迹基因与DNA甲基化型的异常有关。